Przełomowym wiekiem w dziejach Kościoła był wiek IV. W 312 r. Konstantyn odniósł błyskotliwe zwycięstwo nad Maksencjuszem na moście mulwijskim, po uprzednim wprowadzeniu symboli chrześcijańskich na sztandary wojskowe. W 313 r. wydał w Mediolanie edykt tolerancyjny dla chrześcijan, a w 325 r. odbył się pierwszy sobór w Nicei, rozpoczynający długotrwałą batalię z ariańską herezją. Chrześcijaństwo, które przez cały III wiek dynamicznie się rozwijało, stając się wyznaniem dużej części społeczeństwa rzymskiego, z religii prześladowanej, traktowanej podejrzliwie, nie uznawanej, stało się wyznaniem państwowym, otoczonym opieką cesarza, przyjmując na swoje barki ciężar odpowiedzialności za życie zbiorowe państwa.

Co prawda Sobór Nicejski pogrążony w dysputach o naturze Jezusa Chrystusa nie zajmował się Mszą św. wprost, ale spór ze zwolennikami ekskomunikowanego Ariusza wymagał wzmocnienia dyscypliny kościelnej. Potępiono diakonów, którzy ośmielili się spełniać czynności zarezerwowane jedynie dla kapłanów. Sobór stał na stanowisku, że Msza jest rzeczywistą Ofiarą, w czasie której kapłan odnawia Ofiarę Krzyżową, że Chleb i Wino po konsekracji jest Ciałem i Krwią Zbawiciela, a więc Chrystus jest realnie obecny w Eucharystii. Doktryna dotycząca Mszy św. zostanie sprecyzowana na Soborze Efeskim w 431 r.

Analizując szczupłe przekazy źródłowe, m.in. Euchologion Serapiona, tzw. Testament Pański, tzw. Kanon św. Hipolita i źródła wcześniejsze możemy znacznie pewniej nakreślić przebieg Mszy św. w IV w. Msza dzieliła się na dwie części: Mszę katechumenów, dostępną dla wszystkich i Mszę wiernych, zarezerwowaną jedynie dla ochrzczonych katolików.

Msza katechumenów rozpoczynała się od modlitw wstępnych, po których diakon odczytywał fragmenty Starego Testamentu ze stojącej w środku świątyni ambony. Później następowało odczytanie, również przez diakona, dwóch fragmentów z Nowego Testamentu, jednego z Listów lub Dziejów Apostolskich, drugiego z Ewangelii. Czytania przedzielały solowe śpiewy jednego z diakonów, z akrostychem (refrenem) powtarzanym przez wiernych. Po odczytaniu Ewangelii następowała homilia, nazywana logos paraklisios ('nauką odpowiednią'). Po homilii poganom nakazywano opuszczenie świątyni, czego dopilnowywali diakoni. W tym czasie pod przewodnictwem kapłana odśpiewywano litanię, podczas której wierni odpowiadali "Kyrie eleison!", prosząc Boga o łaskę dla katechumenów. Katechumeni opuszczali świątynię po zakończeniu litanii. Rozpoczynała się Tajemnica tajemnic.

Msza wiernych otaczana była czcią, poważne uchybienie rytuałowi mogło pociągać za sobą jej nieważność. Rozpoczynano ją od kolejnej litanii, przewidzianej i nakazanej w 19. kanonie Synodu w Laodycei. Lud pogrążał się w modlitwie. Litania kończyła się zawołaniem kapłana: "Proschomen!" (Baczność!), po którym ofiarnik odmawiał modlitwę. Później następował istniejący jeszcze pocałunek pokoju, przekazywany przez kapłana diakonowi. W świątyniach istniał ścisły podział na część męską i żeńską, pocałunek przekazywano - mężczyzna mężczyźnie, kobieta kobiecie. Nie ma on nic wspólnego z istniejącym w tzw. Nowej Mszy "znakiem pokoju". Po pocałunku pokoju następowały przygotowania do Przeistoczenia. Część badaczy twierdzi, że w tym momencie kapłan przywdziewał uroczyste szaty i obmywał palce (Lavabo). Diakoni upominali wiernych, by godnie zachowywali się w czasie konsekracji, po czym przynosili dary do ołtarza, kładąc chleb i przygotowaną mieszaninę wina z niewielką ilością wody na prawej części ołtarza. Prawdopodobnie z tego powodu w późniejszym okresie przenoszono przed odczytaniem Ewangelii mszał na drugą stronę. Inna hipoteza wiąże się z przeniesieniem mszału wzdłuż drugiej świętej osi (tzw. cardo) południe (Lekcja) - północ (Ewangelia). Diakoni po przyniesieniu darów zajmowali swoje miejsca przy kapłanie, służąc mu - oraz, zwłaszcza w gorących częściach cesarstwa, biorąc flabella, służące do odganiania insektów od ołtarza. W tej chwili następowała Prefacja, Sanctus i konsekracja chleba i wina. Po konsekracji anamneza i epikleza, dwie modlitwy, w których kapłan powoływał się na tajemnice życia Chrystusa i Jego Ofiarę oraz wzywał Boga do zesłania Ducha św. Po XI w., kiedy doszło do schizmy wschodniej, epikleza stała się poważnym utrudnieniem w zażegnaniu konfliktu. Prawosławie przyjmie epiklezę jako nie tylko prośbę o zesłanie Ducha św., ale prawdziwe przemienienie, dokonane przez Niego. Ostatnia część Mszy składała się, tak jak we wcześniejszym wieku, z łamania i spożycia konsekrowanego Chleba i spożycia konsekrowanego Wina oraz rozdawania go wiernym w stanie łaski uświęcającej. Niewiasty przyjmowały Komunię z głową nakrytą welonem. Jak pisze M. Davies, nie ma żadnych przekazów źródłowych, które sugerowałyby przyjmowanie Komunii na rękę w znaczeniu dzisiaj używanym, wręcz przeciwnie - praktyka IV w. pokazuje nam w katechezach św. Cyryla Jerozolimskiego lub późniejszego o wiek bp. syryjskiego Teodoreta, że starano się od niej odchodzić ze względu na fałszywy kult konsekrowanej Hostii. Mszę kończyły modlitwy kapłana i błogosławieństwo poprzedzone słowami "odesłania" (missa, od łac. missio - 'odesłanie'), już po wprowadzeniu łaciny, "Ite missa est!", od których wzięło się pojęcie Mszy św. XIX-wieczny liturgista Bilczewski pisał: "Od gór Kapadocji i wybrzeży Pontu, od Eufratu i katarakt Nilu aż do źródeł Rodanu i Renu, na płaszczyźnie górnej Italii i nad Bosforem, w epoce konstantynowskiej jeden tylko był ryt eucharystyczny służby Bożej".